實(shí)驗(yàn)原理
帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動(dòng)稱(chēng)為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負(fù)電，在電場(chǎng)中都向陽(yáng)極移動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快;反之，則泳動(dòng)速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計(jì)算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。
以醋酸纖維薄膜(CAM)為支持介質(zhì)，電泳分離后經(jīng)染色處理，可展示出清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由于染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比，因此將各蛋白質(zhì)帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫下來(lái)，即可進(jìn)行比色，測(cè)定出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對(duì)含量。也可用一定量的有機(jī)溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計(jì)進(jìn)行掃描定量。
醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便及分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)試劑
1.***—***鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱(chēng)取***2.21克和***鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。
2.染色液
(1)麗春紅S染色液：稱(chēng)取麗春紅S O.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。
(2)氨基黑10B染色液：稱(chēng)取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml無(wú)水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補(bǔ)足至100ml。稱(chēng)取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升。
3.漂洗液。
(1)3%(V/V)醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。
(2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。
4.透明液 取無(wú)水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。
5. 洗脫液
(1)0.1mol/L NaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。
(2)0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。
6.40%(V/V)醋酸溶液。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備 電泳儀、電泳槽、分光光度計(jì)或光密度儀。
實(shí)驗(yàn)材料 醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點(diǎn)樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、電泳槽的準(zhǔn)備
將***-***鈉緩沖液加入電泳槽中(兩側(cè)槽內(nèi)注入等量的緩沖液)，調(diào)節(jié)兩側(cè)內(nèi)的緩沖液，使其在同一水平面，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長(zhǎng)度，用3～4層濾紙或4層紗布搭橋。
2、CAM準(zhǔn)備
取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無(wú)光澤面(涂有醋酸纖維素)距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線(與CAM的長(zhǎng)軸垂直)，作點(diǎn)樣標(biāo)記，將膜條編號(hào)后將無(wú)光澤面朝下浸入***-***鈉緩沖液中，待充分浸透后取出(一般約需求20～30min)，夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.
3、點(diǎn)樣
用血清加樣器將3-5ul無(wú)溶血的新鮮血清均勻地點(diǎn)在劃線處，樣品應(yīng)與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形。待血清滲入膜后移開(kāi)點(diǎn)樣器。點(diǎn)樣應(yīng)注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。
4、平衡
將已點(diǎn)樣的薄膜加樣面朝下，點(diǎn)樣端置于陰極端，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另一端垂入緩沖液中，鹽橋?qū)⒛さ膬啥伺c緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。
5、電泳
正確聯(lián)接電泳槽與整流器對(duì)應(yīng)的正負(fù)極，點(diǎn)樣側(cè)接負(fù)極，另一側(cè)接正極。開(kāi)啟電源通電。調(diào)節(jié)電壓10V～15V/cm膜長(zhǎng),電流0.4～0.6mA/cm膜總寬，電泳40-60分鐘(通常夏季需45min,冬季需60min)，待電泳區(qū)帶展開(kāi)3.5cm～4cm時(shí)即可關(guān)閉電源。
6、染色
通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分鐘。
7、漂洗
至少準(zhǔn)備3～4個(gè)漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復(fù)漂洗，直至背景漂白為止。此時(shí)清晰可見(jiàn)5條色帶。待干。
8、定量
(1)洗脫比色法 取六支試管，分別標(biāo)明“A、α1、α2、β、γ、空白”。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應(yīng)的試管內(nèi)，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，根據(jù)染色不同按以下方法洗脫。
①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內(nèi)加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數(shù)次，置37℃水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。
②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內(nèi)加入40%(V/V)醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。
(2)光密度掃描法
① 透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上(應(yīng)無(wú)氣泡)，直立片刻除去過(guò)多的透明液。于90～100℃烘箱內(nèi)烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM，各蛋白區(qū)帶鮮明，薄膜平整，可直接掃描或作保存。若用十萘氫或液體石醋透明，應(yīng)將漂洗過(guò)的薄膜烘干后進(jìn)行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易發(fā)生皺折。
② 掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動(dòng)光密度計(jì)或其它光密度掃描的光路，選擇波長(zhǎng)520nm，描記各蛋白區(qū)帶峰，并計(jì)算各蛋白成分的相對(duì)含量。
9、計(jì)算
定量計(jì)算時(shí)，先計(jì)算各光密度值的總和：再計(jì)算血清各部分蛋白質(zhì)所占的百分率
吸光度總和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清各蛋白組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù)=Ax/AT×
Ax表示各球蛋白組分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。
A%=2A/ T× β=β/ T×
α1%=α1/ T× γ%=γ/ T× α2%=α2/ T×
各組分蛋白質(zhì)含量(g/L)=(各組分蛋白百分?jǐn)?shù)(%)×血清總蛋白g/L)/100
10、臨床意義
(1)血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：
蛋白質(zhì)組分 g/L 占總蛋白百分比(%)
白蛋白 35～52 57.0～68.0
α1球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7
α2球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2
β球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0
γ球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2
(2)臨床意義
電泳圖譜可為臨床**診斷依據(jù)。
腎病型可見(jiàn)于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，α2和β升高;肝硬化型可見(jiàn)于慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬變等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，β和γ增高，可出現(xiàn)β與γ難以分離而連接在一起的“β-γ”橋，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導(dǎo)致IgA增高所致;急性反應(yīng)時(shí)相型常以α1、α2增高為特征;慢性炎癥型則以Alb降低，α2、γ增高較為常見(jiàn);M蛋白血癥主要見(jiàn)于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(zhì)(主要是IgG或IgA)，電泳時(shí)可在β和βγ之間出現(xiàn)一條峰形狹窄的區(qū)帶，稱(chēng)M區(qū)帶。
注意事項(xiàng)
1.通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM，以防觸電。
2.每次電泳時(shí)應(yīng)交換電極以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在一定水平。
3.電泳緩沖液的液面要保持一定的高度，過(guò)低可能會(huì)出現(xiàn)γ球蛋白的電滲現(xiàn)象(γ球蛋白向陰極移動(dòng))，同時(shí)電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同一水平，否則，通過(guò)薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，將會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)速度。
4.電泳失敗或圖譜不理想的常見(jiàn)原因
(1)電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分：點(diǎn)樣過(guò)多;點(diǎn)樣不均勻、不整齊;薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散;點(diǎn)樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或溫度過(guò)高致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā);緩沖液變質(zhì);電泳時(shí)薄膜放置不正，歪斜、彎曲，與電流方向不平行;樣品不新鮮;電流過(guò)低;CAM質(zhì)量不好，薄膜結(jié)構(gòu)過(guò)分細(xì)密，透水性差，導(dǎo)電差等。
(2)染色后白蛋白中間著色淺：染色時(shí)間不夠或染色液陳舊;白蛋白含量過(guò)高，可減少血清用量或延長(zhǎng)染色時(shí)間。
(3)電泳速度慢：電流過(guò)低;供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過(guò)薄;溫度過(guò)低;薄膜結(jié)構(gòu)過(guò)分細(xì)密，透水性差，導(dǎo)電差;緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強(qiáng)度增大。
(4)薄膜透明不完全：透明液陳舊;浸泡時(shí)間不足;烘箱溫度未到90℃即把薄膜放入。
5.染料問(wèn)題：各種染料對(duì)血清各組分有不同的親和力，大多數(shù)染料對(duì)白蛋白的親和力大于球蛋白。如氨基黑10B對(duì)球蛋白的結(jié)合力為白蛋白的80%，因此常導(dǎo)致白蛋白結(jié)果偏高，球蛋白偏低。用麗春紅S染色，效果優(yōu)于氨基黑10B。麗紅是一種指示劑，PH<10時(shí)呈紅色，PH>12.5時(shí)呈紫色。在酸性溶液中它的大吸收峰在523nm左右，呈對(duì)稱(chēng)性。在血清蛋白正常濃度范圍內(nèi)，麗春紅S能與各蛋白質(zhì)組分成正比例結(jié)合，而氨基黑10B則對(duì)白蛋白染色過(guò)深，區(qū)帶中容易出現(xiàn)著色不全的小點(diǎn)，不夠理想。
6.樣品要求點(diǎn)在粗糙面(無(wú)光澤面)，否則樣品很難吸入膜內(nèi)。電泳時(shí)好將點(diǎn)有樣品的一面朝下，以防電泳過(guò)程中水分蒸發(fā)，影響電泳結(jié)果。
7.標(biāo)本應(yīng)新鮮，不得溶血。溶血標(biāo)本會(huì)使β球蛋白假性升高，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區(qū)域內(nèi)。